Search for content and authors
 

Wykorzystanie metody NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) w ocenie wielkości krążących mikrocząstek osocza i innych płynów fizjologicznych: pułapki i triki

Martyna M. Durak 1Witold Łojkowski 2Jacek Wojnarowicz 2Ewa Stępień 1

1. Uniwersytet Jagielloński, Instytut Fizyki, Zakład Fizyki Medycznej, Łojasiewicza 1, Kraków 30-387, Poland
2. Instytut Wysokich Ciśnień PAN (IWC), Sokołowska 29/37, Warszawa 01-142, Poland

Abstract

Wstęp: Krążące mikrocząstki (MP) osocza są to mikropęcherzyki, których głównym źródłem są płytki krwi, komórki śródbłonka, makrofagi oraz inne komórki krwi. Na ich uwalnianie mają wpływ czynniki zapalne, niedotlenienie, uszkodzenia mechaniczne oraz bodźce wywołujące stymulację komórek naczyń, takie jak hiperglikemia oraz hiperhomocysteinemia. Ponadto komórki nowotworowe wytwarzają i uwalniają dużo MP, które mogą być wykrywane w krwi i innych płynach ustrojowych. Przypuszcza się, że za pośrednictwem MP komórki wymieniają między sobą "informację" w postaci uwalnianych i transportowanych na długie dystanse makromolekuł. Istotną rolą MP jest ich udział w procesach hemostazy, angiogenezy oraz organogenezy.

Rozwój diagnostyki laboratoryjnej zmierza z jednej strony do poszukiwania nowych markerów diagnostycznych, z drugiej strony do miniaturyzacji urządzeń, wprowadzania do klinicznego laboratorium diagnostycznego nowych metod, wykorzystywanych w nanotechnologii.

Do oceny ilościowej i jakościowej MP możemy wykorzystać zarówno metody molekularne i powszechnie stosowane techniki mikroskopowe, wykorzystujące zjawisko fluorescencji specyficznych barwników- etykiet dla białek lub kwasów nukleinowych (cytometria przepływowa, mikroskopia konfokalna, techniki mikromacierzy). Coraz częściej sięga się w diagnostyce laboratoryjnej po metody wykorzystywane w nanotechnologii, głównie w przemyśle chemicznym, takie jak: NTA (Nanoparticle Tracking Analysis), Z-NTA (Zeta Potential Nanoparticle Tracking Analysis), TRPS qNano (Tunable Resistive Pulse Sensing- Izon particle sizing) oraz DLS ( Dynamic Light Scattering). Wszystkie metody pozwalają określić wielkość MP, agregację cząstek oraz przedstawić w sposób ilościowy rozkład wielkości MP w próbce. Jedynie metody Z-NTA oraz NTA pozwalają zmierzyć koncentrację MP w oznaczanym materiale.

Metoda NTA oraz DLS wykorzystują analizę ruchów Browna, będących nieuporządkowanymi i chaotycznymi ruchami cząstek w roztworach cieczy. Metoda NTA skupia się na analizie odległości przebytej przez cząstkę, podczas gdy DLS koncentruje się na analizie intensywności światła rozproszonego poprzez poruszające się MP. Nieodzownym pojęciem związanym z metodą Z-NTA oraz qNano jest zeta-potencjał, który ma zasadnicze znaczenie dla określenia stopnia wzajemnego odpychania się cząstek.

Metoda NTA mierzy cząstki z zakresu od 10-40 nm do 1-2μm. Minimalna koncentracja, którą można oznaczyć przy użyciu tej metody to około 106cząstek/mL, natomiast wartość maksymalna to około 1010cząstek/mL. Istotną różnicą pomiędzy metodą NTA i DLS jest pomiar wielkości MP w próbkach polidyspersyjnych. Pierwsza metoda ukazuje piki przy wielkościach dominujących MP badanej mieszaniny, natomiast w DLS uzyskuje się jedynie wartość średnią. Dodatkowo metoda NTA umożliwia analizę cząstek o właściwościach fluorescencyjnych oraz pozwala wykorzystać lasery (niebieski i zielony) zdolne wzbudzić zarówno fluorofory jak i kropki kwantowe. 

W alternatywnej metodzie qNano, w sposób bezpośredni mierzy się ładunek cząstek przechodzących przez nanopory, który jest proporcjonalny do objętości nanocząstki lub mikrocząstki. Wykorzystuję się zasadę pomiaru spadku potencjału (ΔR) po przejściu mikrocząstki o objętości d3 przez porowatą membranę o średnicy pora D, gdzie ρ oznacza opór właściwy cieczy (elektrolitu) w jakiej cząstki są zawieszone.

Cel: Założeniem przeprowadzonych badań była charakterystyka metody NTA w celu późniejszych zastosowań tej metody do oceny wielkości krążących MP osocza i innych płynów ustrojowych. Metody: Pobrane próbki krwi odwirowano dwukrotnie przez 15minut w 2500G w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osocza ubogopłytkowego (PPP). PPP następnie odwirowano przez 90minut w temperaturze 4°C w 16000G, aby uzyskać frakcję MP. Zarówno frakcję MP jak i nadsącz zbadano przy użyciu analizatora NS500 (Nanosight Ltd, Amesbury, Wielka Brytania), w celu określenia wielkości krążących MP. W urządzeniu NS500 wyposażonym w laser niebieski o długości fali 405nm wykorzystywane było zjawisko rozproszenia światła na MP zawieszonych w medium (rozpuszczalniku) o różnych właściwościach fizykochemicznych, w temperaturze 23,3°C.

Analizowane próbki rozcieńczono 200- oraz 1000- krotnie w:
  • W- woda destylowana
  • S- sól fizjologiczna
  • ABB- bufor do cytometrii przepływowej- Annexin V binding buffer (BD Biosciences, USA), w skład którego wchodzi 0.1M Hepes (pH 7.4), 1.4M NaCl oraz 25mM roztwór CaCl2. Przed dokonaniem pomiaru ABB rozpuszczono 10-krotnie w wodzie destylowanej, zgodnie z zaleceniem producenta. 
Wyniki:
  1. W próbkach, w których jako rozpuszczalnik zastosowano wodę, zarówno w nadsączu jak i we frakcji MP, wykryto cząstki wielkości 100nm, tak zwane małe MP (mMP), jak również zaobserwowano duże MP (dMP) o średnicy 300-650nm. Średnia wielkość MP w nadsączu wyniosła 157,00nm, a zakres wielkości MP 20-600nm, podczas gdy średnia wielkość MP we frakcji wyniosła 175,60nm, a zakres wielkości 30-650nm.
  2. Użycie soli fizjologicznej jako rozpuszczalnika spowodowało, że w obu pomiarach dMP były wykrywane. Średnia wielkość MP w nadsączu wyniosła 160,00nm, podczas gdy we frakcji MP wyniosła  146,70nm. Zakres wielkości MP w nadsączu wynosił 20-450nm, natomiast we frakcji wynosiła MP 30-500nm.
  3. Wykorzystanie buforu do cytometrii spowodowało, że dokonując pomiaru można było uzyskać rezultat przeprowadzonego wirowania. Tylko we frakcji MP można było zaobserwować dMP. Średnia wielkość MP we frakcji wyniosła 110,20nm, podczas gdy w nadsączu wynosiła 89,69nm.

Wnioski:   Uzyskane wyniki pokazały, że dobór rozpuszczalnika ma wpływ na uzyskane rezultaty. Właściwości użytych rozpuszczalników w sposób pośredni mogą wpłynąć na wielkość badanych MP. Jedynie zastosowanie buforu do cytometrii, który posiada właściwości sprzyjające agregacji cząstek, umożliwił uzyskanie wyników pokazujących skuteczność wirowania.

Zastosowanie wody destylowanej jako rozpuszczalnika mogło wywołać zjawisko agregacji MP bądź osmozy. Wykazano, że rozkład wielkości badanych MP był znacząco większy w odniesieniu do wyników uzyskanych przy użyciu innych rozpuszczalników.

Izotoniczny charakter soli fizjologicznej zapobiega agregacji cząstek oraz zjawisku osmozy. Mając na uwadze właściwości PBS-u oraz uzyskane wyniki, należy zastanowić się czy stosowane parametry wirowania (16000G) są wystarczające do sedymentacji dMP do frakcji MP, w celu wyeliminowania ich z nadsączu.

Zanalizowanie rozkładu wielkości MP stanowi etap poprzedzający analizę fenotypową MP. Wykorzystanie metody NTA  pozwala potwierdzić skuteczność przeprowadzonego wirowania, co jest niezbędną procedurą do rozpoczęcia badań dotyczących antygenów powierzchniowych MP przy użyciu cytometrii przepływowej, oraz zbadania ekspresji białek i genów przez nie transportowanych, przy użyciu odpowiednio metody Western Blot oraz qPCR.

 

Legal notice
  • Legal notice:
 

Related papers

Presentation: Poster at Nano PL 2014, Symposium B, by Martyna M. Durak
See On-line Journal of Nano PL 2014

Submitted: 2014-07-01 04:02
Revised:   2014-07-17 15:07