Wykorzystanie metody NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) w ocenie wielkości krążących mikrocząstek osocza i innych płynów fizjologicznych: pułapki i triki

Martyna M. Durak 1Witold Łojkowski 2Jacek Wojnarowicz 2Ewa Stępień 1

1. Uniwersytet Jagielloński, Instytut Fizyki, Zakład Fizyki Medycznej, Łojasiewicza 1, Kraków 30-387, Poland
2. Instytut Wysokich Ciśnień PAN (IWC), Sokołowska 29/37, Warszawa 01-142, Poland

Abstract

Wstęp: Krążące mikrocząstki (MP) osocza są to mikropęcherzyki, których głównym źródłem są płytki krwi, komórki śródbłonka, makrofagi oraz inne komórki krwi. Na ich uwalnianie mają wpływ czynniki zapalne, niedotlenienie, uszkodzenia mechaniczne oraz bodźce wywołujące stymulację komórek naczyń, takie jak hiperglikemia oraz hiperhomocysteinemia. Ponadto komórki nowotworowe wytwarzają i uwalniają dużo MP, które mogą być wykrywane w krwi i innych płynach ustrojowych. Przypuszcza się, że za pośrednictwem MP komórki wymieniają między sobą "informację" w postaci uwalnianych i transportowanych na długie dystanse makromolekuł. Istotną rolą MP jest ich udział w procesach hemostazy, angiogenezy oraz organogenezy.

Rozwój diagnostyki laboratoryjnej zmierza z jednej strony do poszukiwania nowych markerów diagnostycznych, z drugiej strony do miniaturyzacji urządzeń, wprowadzania do klinicznego laboratorium diagnostycznego nowych metod, wykorzystywanych w nanotechnologii.

Do oceny ilościowej i jakościowej MP możemy wykorzystać zarówno metody molekularne i powszechnie stosowane techniki mikroskopowe, wykorzystujące zjawisko fluorescencji specyficznych barwników- etykiet dla białek lub kwasów nukleinowych (cytometria przepływowa, mikroskopia konfokalna, techniki mikromacierzy). Coraz częściej sięga się w diagnostyce laboratoryjnej po metody wykorzystywane w nanotechnologii, głównie w przemyśle chemicznym, takie jak: NTA (Nanoparticle Tracking Analysis), Z-NTA (Zeta Potential Nanoparticle Tracking Analysis), TRPS qNano (Tunable Resistive Pulse Sensing- Izon particle sizing) oraz DLS ( Dynamic Light Scattering). Wszystkie metody pozwalają określić wielkość MP, agregację cząstek oraz przedstawić w sposób ilościowy rozkład wielkości MP w próbce. Jedynie metody Z-NTA oraz NTA pozwalają zmierzyć koncentrację MP w oznaczanym materiale.

Metoda NTA oraz DLS wykorzystują analizę ruchów Browna, będących nieuporządkowanymi i chaotycznymi ruchami cząstek w roztworach cieczy. Metoda NTA skupia się na analizie odległości przebytej przez cząstkę, podczas gdy DLS koncentruje się na analizie intensywności światła rozproszonego poprzez poruszające się MP. Nieodzownym pojęciem związanym z metodą Z-NTA oraz qNano jest zeta-potencjał, który ma zasadnicze znaczenie dla określenia stopnia wzajemnego odpychania się cząstek.

Metoda NTA mierzy cząstki z zakresu od 10-40 nm do 1-2μm. Minimalna koncentracja, którą można oznaczyć przy użyciu tej metody to około 106cząstek/mL, natomiast wartość maksymalna to około 1010cząstek/mL. Istotną różnicą pomiędzy metodą NTA i DLS jest pomiar wielkości MP w próbkach polidyspersyjnych. Pierwsza metoda ukazuje piki przy wielkościach dominujących MP badanej mieszaniny, natomiast w DLS uzyskuje się jedynie wartość średnią. Dodatkowo metoda NTA umożliwia analizę cząstek o właściwościach fluorescencyjnych oraz pozwala wykorzystać lasery (niebieski i zielony) zdolne wzbudzić zarówno fluorofory jak i kropki kwantowe. 

W alternatywnej metodzie qNano, w sposób bezpośredni mierzy się ładunek cząstek przechodzących przez nanopory, który jest proporcjonalny do objętości nanocząstki lub mikrocząstki. Wykorzystuję się zasadę pomiaru spadku potencjału (ΔR) po przejściu mikrocząstki o objętości d3 przez porowatą membranę o średnicy pora D, gdzie ρ oznacza opór właściwy cieczy (elektrolitu) w jakiej cząstki są zawieszone.

Cel: Założeniem przeprowadzonych badań była charakterystyka metody NTA w celu późniejszych zastosowań tej metody do oceny wielkości krążących MP osocza i innych płynów ustrojowych. Metody: Pobrane próbki krwi odwirowano dwukrotnie przez 15minut w 2500G w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osocza ubogopłytkowego (PPP). PPP następnie odwirowano przez 90minut w temperaturze 4°C w 16000G, aby uzyskać frakcję MP. Zarówno frakcję MP jak i nadsącz zbadano przy użyciu analizatora NS500 (Nanosight Ltd, Amesbury, Wielka Brytania), w celu określenia wielkości krążących MP. W urządzeniu NS500 wyposażonym w laser niebieski o długości fali 405nm wykorzystywane było zjawisko rozproszenia światła na MP zawieszonych w medium (rozpuszczalniku) o różnych właściwościach fizykochemicznych, w temperaturze 23,3°C.

Analizowane próbki rozcieńczono 200- oraz 1000- krotnie w:
  • W- woda destylowana
  • S- sól fizjologiczna
  • ABB- bufor do cytometrii przepływowej- Annexin V binding buffer (BD Biosciences, USA), w skład którego wchodzi 0.1M Hepes (pH 7.4), 1.4M NaCl oraz 25mM roztwór CaCl2. Przed dokonaniem pomiaru ABB rozpuszczono 10-krotnie w wodzie destylowanej, zgodnie z zaleceniem producenta. 
Wyniki:
  1. W próbkach, w których jako rozpuszczalnik zastosowano wodę, zarówno w nadsączu jak i we frakcji MP, wykryto cząstki wielkości 100nm, tak zwane małe MP (mMP), jak również zaobserwowano duże MP (dMP) o średnicy 300-650nm. Średnia wielkość MP w nadsączu wyniosła 157,00nm, a zakres wielkości MP 20-600nm, podczas gdy średnia wielkość MP we frakcji wyniosła 175,60nm, a zakres wielkości 30-650nm.
  2. Użycie soli fizjologicznej jako rozpuszczalnika spowodowało, że w obu pomiarach dMP były wykrywane. Średnia wielkość MP w nadsączu wyniosła 160,00nm, podczas gdy we frakcji MP wyniosła  146,70nm. Zakres wielkości MP w nadsączu wynosił 20-450nm, natomiast we frakcji wynosiła MP 30-500nm.
  3. Wykorzystanie buforu do cytometrii spowodowało, że dokonując pomiaru można było uzyskać rezultat przeprowadzonego wirowania. Tylko we frakcji MP można było zaobserwować dMP. Średnia wielkość MP we frakcji wyniosła 110,20nm, podczas gdy w nadsączu wynosiła 89,69nm.

Wnioski:   Uzyskane wyniki pokazały, że dobór rozpuszczalnika ma wpływ na uzyskane rezultaty. Właściwości użytych rozpuszczalników w sposób pośredni mogą wpłynąć na wielkość badanych MP. Jedynie zastosowanie buforu do cytometrii, który posiada właściwości sprzyjające agregacji cząstek, umożliwił uzyskanie wyników pokazujących skuteczność wirowania.

Zastosowanie wody destylowanej jako rozpuszczalnika mogło wywołać zjawisko agregacji MP bądź osmozy. Wykazano, że rozkład wielkości badanych MP był znacząco większy w odniesieniu do wyników uzyskanych przy użyciu innych rozpuszczalników.

Izotoniczny charakter soli fizjologicznej zapobiega agregacji cząstek oraz zjawisku osmozy. Mając na uwadze właściwości PBS-u oraz uzyskane wyniki, należy zastanowić się czy stosowane parametry wirowania (16000G) są wystarczające do sedymentacji dMP do frakcji MP, w celu wyeliminowania ich z nadsączu.

Zanalizowanie rozkładu wielkości MP stanowi etap poprzedzający analizę fenotypową MP. Wykorzystanie metody NTA  pozwala potwierdzić skuteczność przeprowadzonego wirowania, co jest niezbędną procedurą do rozpoczęcia badań dotyczących antygenów powierzchniowych MP przy użyciu cytometrii przepływowej, oraz zbadania ekspresji białek i genów przez nie transportowanych, przy użyciu odpowiednio metody Western Blot oraz qPCR.

 

Related papers
  1. Optical oxygen sensor for safe operation in hazardous areas
  2.   Optical oxygen sensor for safe operation  in hazardous areas
  3. Quo Vadis nanotechnology- for various stakeholders
  4. Opening of the Thursday Sessions of NanoPl 2014
  5. Microwave reactors for nanoparticle's synthesis
  6. Opening of Nano-Bio-Med session
  7. Bioactive GoHAP nanoparticles and their applications in medical implants technology
  8. Advanced characterisation of nanomaterials according to ISO 17025 Norm

  9. Microwave solvothermal synthesis of resorbable nano-HAp with controlled grain size.
  10. Microwave Solvothermal Synthesis of High Quality Nanoparticles
  11. Microwave Solvothermal Synthesis of Nano Zinc Oxide Nanoparticles
  12. Microwave Solvothermal Technology (MSS) for nanoparticle synthesis
  13. Zaawansowana Charakteryzacja Nanocząstek
  14. [CEPT] Solvothermal synthesis nano zinc oxide in  microwave reactor MSS2
  15. [CEPT] Solvothermal synthesis and characterization of nanomaterials in the Laboratory of Nanostructures for Photonics and Nanomedicine, Center of Bio-Nanomaterials
  16. Scanning Electron Microscopy Investigations and Analysis of Nanostructures
  17. Polish Nanotechnology Platform - a discussion group at Linked-In
  18. Novel optical oxygen sensor for life and health protection made of nano-zirconia
  19. Nanometrology as a tool for nanotechnology problems solving
  20. Creating a Polish Nano-Bio-Technology and  Nano-Medicine Platform?
  21. MSS synthesis of highly biocompatible nano-HAP and coating of 3D poymer scaffolds
  22. Nanotechnologie w gospodarce województwa podlaskiego
  23. Characterization of nanomaterials according to EU recommendations, on the example of ZnO nanoparticles
  24. [CEPT] Nanohydroxyapatite-polylactide composites  for regenerative implants
  25. [CEPT] MSS synthesis of highly biocompatible nano-HAP with properties depending on the synthesis time.
  26. [CEPT] Studies of nanoparticles size distribution
  27. [CEPT] Studies of solubility of nanoparticles and stability of their suspension
  28. Iinvestigation of nanoparticles by DSC-TG methods accompanied by chemical analysis of emitted gas
  29. Green Technology and Pilot Unit for Manufacturing of Ultra Clean Concentrated Colloids of Nano Metals
  30. Presentation of the  Laboratory of Nanostructures for Photonics and Nanomedicine, Center of Bio-Nanomaterials, CePT
  31. ZnO nanoparticles effect on integrity of human endothelial cells
  32. Importance and trends in nanomedicine according  European Nanomedicine Platform survey
  33. Application of the Zeiss Ultra Plus scanning microscopy in bio-nanotechnology 
  34. Welcome address
  35. Otwarcie NanoInfoDay, Powitanie
  36. Characteristic of hydroxyapatite dense nanoceramic produced by The High Pressure Consolidation  
  37. Wpływ parametrów materiałowo-technicznych na właściwości optycznego czujnika tlenu na bazie nano-ZrO2
  38. Synteza nano-ZnO przy pomocy reaktora Mettler Toledo w Laboratorium Nanostruktur dla Fotoniki i Nanomedycyny CePT.
  39. Infrastruktura i specjalizacje nanotechnologii w Polsce na podstawie wyników ankiety NANOFORCE
  40. Solwotermalna synteza domieszkowanego nanotlenku cynku dla projektu NanoFATE. Otrzymywanie wodnych nanozawiesin domieszkowanego tlenku cynku.
  41. Nanotechnologia bezpieczna dla ludzi i przyjazna środowisku
  42. Badania rozkładu wielkości cząstek i potencjału zeta w Laboratorium Nanostruktur dla Fotoniki i Nanomedycyny CePT
  43. Badanie stabilności i rozpuszczalności zawiesin z nano ZnO i nano ZnO:Co otrzymanych w  Laboratorium Nanostrutur dla Fotoniki i Nanomedycyny CePT
  44. Badania nanoproszków przy pomocy technik DSC-TG/ QMS-FTIR w Laboratorium Nanostruktur dla Fotoniki i Nanomedycyny CePT
  45. Synthesis of highly biocompatible hydroxyapatite nanopowders
  46. Nanosafety - challenge of nowadays
  47. Influence of heat treatment on luminescence of ZrO+ Eu nanopowders
  48. Solvothermal synthesis of doped nano zinc oxide for the project NanoFATE.
  49. Podsumowanie
  50. Solwotermalna synteza domieszkowanego nano tlenku cynku dla projektu NanoFATE.
  51. Hydrothermal Synthesis of Zinc Oxide Nanopowders
  52. Optyczny sensor tlenu na bazie nanokrystalicznego ZrO2
  53. Solvothermal synthesis of nonstoichiometric hydroxyapatite nanoparticles
  54. Solvothermal synthesis of nonstoichiometric hydroxyapatite nanoparticles
  55. Procedury charakteryzacji nanoproszków
  56. Oferty nanoproszków - Laboratorium Nanostruktur, Instytut Wysokich Ciśnien PAN
  57. Nanofotonika dla małych i średnich przedsiębiorstw - mapy dorogowe i analizy SWOT  najważniejszych technologii.
  58. Otwarcie konferencji
  59. Polska  Platforma Nanotechnologii i zarys strategicznego programu "Nanotechnologia i wzrost inwestycji w B&R w Polsce"
  60. Nowe mikrofalowe reaktory do syntez nanocząstek - wybrane zagadnienia badawcze i przykłady zastosowań
  61. ZrO2:Tb nanopowders obtained by coprecipitation method
  62. ZnFe2O4/ZnO core-shell particles obtained by coprecipitation route
  63. Hydrothermal Synthesis of ZnAl2O4 Spinel
  64. Localization of rare-earth dopants in the lattice of nanocrystalline ZrO2 - EXAFS study
  65. Advanced nanoporous yttria-stabilized zirconia ceramics for luminescent oxygen sensors
  66. Excitation transfer in zirconia nanocrystals and ceramics
  67. Eu Luminescence in zirconia nanocrystals
  68. ZnO ceramic sintering and luminescence properties
  69. Oferta zaawansowanych materiałów w perspektywie 5 - 20 lat
  70. Strategia rozwoju badań nanoproszków
  71. Error bars in powder diffraction
  72. Synthesis of doped ZnO nanopowders in microwave hydrothermal reactors
  73. Characterization of nanopowders
  74. Synthesis of Al doped ZnO nanopowders and their enhanced luminescence
  75. Synthesis of nanopowders in supercritical water in a continuous flow reactor
  76. A summary of results obtained in Working Group 002 "Synthesis and Processing of Nanopowders"
  77. Summary of activities of Working Group D30/003 "Synthesis and Processing of Nanopowders"
  78. Doped zirconia nanopowders made in microwave – pressure reactor
  79. Combining microwave and pressure techniques for hydrothermal synthesis of ZnO and ZrO2 nanopowders doped with a range of metal ions
  80. Luminescence properties of zinc oxide nanopowders doped with Al ions obtained by the hydrothermal and vapour condensation methods.
  81. Mechanical property of nano-TiO2 dispersed Al65Cu20Ti15 amorphous/nanocrystalline matrix bulk composite prepared by mechanical alloying and high pressure sintering
  82. Microwave technique applied on the hydrothermal synthesis and sintering of calcia stabilized zirconia nanoparticles
  83. Luminescence properties of cerium doped Y3Al5O12 nanopowders and nanoceramic
  84. Yttrium-Aluminum Garnet Synthesized in the Medium of Supercritical Fluids
  85. Advanced nanostructural zirconia ceramics for optical oxygen sensors
  86. Study of undoped and doped zirconia nanocrystals luminescence
  87. Doping of ZnO nanopowders with Mn, Ni and Cr In an ultrasound and microwave driver hydrothermal reaction
  88. Localization of rare-earth dopants in the lattice of nanocrystalline ZrO2 - EXAFS study
  89. Zirconia-based nanomaterials for oxygen sensor - generation, characterisation and optical properties
  90. Production of doped and non doped ceramics nanoparticles for optical applications
  91. Synthesis, sintering and properties of doped nanocrystalline powders of zirconia, zinc oxide and yttrium aluminum garnet (YAG)
  92. Characterization of nanocrystalline ZrO2 doped with Rare-Earth elements synthesized via High Pressure Hydrothermal Method
  93. Particle Size Distribution of ZrO2:Pr3+- Influences of pH, High Power Ultrasound, Surfactant and Dopant Quantity
  94. Time-Resolved Luminescence Characteristics of Doped YAG and YAP Nanopowders
  95. Cathodoluminescence of Al doped ZnO nanopowders
  96. Morphology of Al doped Zinc Oxide Obtained using Hydrothermal and Vapour Condensation Methods
  97. Luminescence and structural properties of rare-earth doped YAG nanoceramics
  98. Optimization of conditions of preparation of YAG nanopowders for sintering of translucent ceramics
  99. The influence of ZrO2 containing 10% Eu 3+ on the polyurethane hard domain structure of nano-composites with luminescence properties
  100. Growth and properties of ytterbium doped KY(WO4)2 nanocomposites
  101. Investigations on the utilization of nano zinc oxides synthesized by hydrothermal method in rubber compounds
  102. Doping of ZnO nanopowders with Mn and Cr in an ultrasound and microwave driven hydrothermal reaction
  103. Investigations of phase composition and grain size distribution in Pr doped ZrO2
  104. Nasze wyniki, zdania i sposoby ich realizacji
  105. Morphology of Al doped zinc oxide obtained by the vapour condensation method
  106. The comparison of the properties of YAG obtained by coprecipitation and SCR method
  107. Synthesis of nanopowders at elevated pressure and their characterisation - summary of work of the WG-002
  108. Accuracy of XRD size measurements of nanocrystals
  109. Morphology of Al-Doped Zinc Oxide Obtained by the Vapour Condensation Methods
  110. SWOT analysis of various reactors used for synthesis of nanopwoders in our Working Group
  111. Preliminary research on zirconia based optical oxygen sensor
  112. Preparation and electrical properties of the BaTiO3 nanoceramics
  113. Current trends in the development of metallic nanomaterials: results of a study carried out within the EC project Nanoroad SME
  114. Microstructural Evolution in Mechanical Alloying and Hot Pressing of Aluminium and 316 Stainless Steel Powder Blend
  115. Time-resolved luminescence of nanostructured ZnO
  116. Prediction of degree of localisation of misfit dislocation cores in intercrystalline interfaces based on interfacial adhesion
  117. Kinetic and thermodynamic factors leading to dissolution of cementite in pearlitic steel subjected to severe plastic deformation under pressure
  118. Yttria stabilized zirconia nanocrystals luminescence
  119. Application of XRD diffraction methods for determination of grain size distribution in nanoparticles
  120. Optical investigations of RE-doped YAG nanoceramics
  121. Electrical properties of nanocrystalline ZrO2 at high-pressure
  122. High-pressure Induced Structural Decomposition of RE-doped YAG Nanoceramics
  123. Synthesis of Al-doped ZnO nanomaterials with controlled luminescence properties
  124. Combination of ECAP and Hydrostatic Extrusion for ultra-fine grain (UFG) microstructure generation in 99.98% nickel.
  125. Mechanical properties and deformation behaviour of ultra-fine grained nickel.
  126. Grain Size and Grain Size Distribution of Nanocrystalline Pr-doped Zirconia Powders Obtained in High Pressure Microwave Reactor
  127. Influence of synthesis conditions on the particles size and the morphology of zinc oxide nanopowders
  128. Measuring the Grain Size Distribution of Pr-doped Zirconia Nanopowders obtained by Microwave Driven Hydrothermal Synthesis
  129. Excellent mechanical properties of UFG metals and alloys, subjected to combination of severe plastic deformation methods.
  130. An FT-IR Spectroscopic Investigation of Hydroxide Groups in Nano-Crystals of ZrO2.
  131. Development of microstructure and mechanical properties in nickel deformed by hydrostatic extrusion
  132. Structural and luminescence properties of yttrium-aluminum garnet (YAG) nanoceramics
  133. Biocompatibility of thin films based on hydrothermal synthesized HAp
  134. Hybrid HAp- maleic anhydride copolymer nanocomposites obtained by in situ functionalisation
  135. Fabrication and electrical properties of Eu3+:BaTiO3 nanoceramics for SOFC
  136. Luminescence of ZrO2 nanocrystals
  137. Molecular impurities in the luminescent ZnO nanocrystals
  138. X-Ray investigations of the natural and artificial White Etching Layer
  139. Diffusion and diffusion induced defects in GaN
  140. Excellent Mechanical Properties of Nickel Processed by High Pressure Techniques
  141. Microwave driven hydrothermal synthesis of iron oxide - the effect of process parameter on the properties of the nanopowders
  142. Relaxation processes in ZrO2 at high pressures
  143. Luminescence of ZrO2 and ZnO nanocrystals
  144. Zinc oxide nanopowders obtained by the microwave-hydrothermal route
  145. Microwave driven hydrothermal synthesis of Pr-doped zirconia nanopowders
  146. New hydroxyapatite based nanomaterials for potential use in medical fields
  147. Correlation between high-pressure ZrO2 electrical properties and crystallite size
  148. Precise determination of full Grain Size Distribution from diffraction peak profile as a result of kinematical theory of diffraction for polidispersive nanomaterials
  149. Pressure Effect on Grain Boundary Diffusion in Al Bicrystals
  150. Microstructure of Surface Layers of Raiways After Heavy Exploatation
  151. Normal Grain Growth in 2-d Strips of Polycrystalline Aluminium Under High Pressure
  152. Reaction Diffusion in Metallic Systems under High Pressure
  153. High Pressure Effect on Grain Boundary Wetting in Aluminium Bicrystals
  154. Pressure Effect on Interface Energy, Diffusion and Reactions
  155. Microwave-Hydrothermal Synthesis of Nanostructured Pr-Doped Zirconia Powders
  156. The Strain Induced Cementite Dissolution in Carbon Steels-Experimental Facts and Theoretical Approach
  157. Effect of SPD Grain Refinement and Peculiarity of Structure and Mechanical Properties of UFG Ni
  158. Luminescense of Nanosize ZrO2
  159. Structure, Morphology and Luminescence Properties of Pr-doped Nanocrystalline ZrO2 Obtained by Hydrothermal Method
  160. Nanostructure Formation on the Surface of Railway Tracks and Wheelsets
  161. Hydrothermal Synthesis of Zinc Oxide Nanopowders with Microwaves Applications
  162. Microwave Driven Hydrothermal Synthesis of Iron Oxide Nanopowders
  163. Indentation Technique for Determination if Mechanical Behavior of Nanomaterials (Bulk and Coatings)

Presentation: Poster at Nano PL 2014, Symposium B, by Martyna M. Durak
See On-line Journal of Nano PL 2014

Submitted: 2014-07-01 04:02
Revised:   2014-07-17 15:07